Центр коллективного пользования ИБГ РАН. В 1981 году был изобретен сканирующий туннельный микроскоп (СТМ) – первый из семейства зондовых микроскопов.


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте файл и откройте на своем компьютере.
КОЛЛЕКТИВНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ ИБГ РАН МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ МОСКВА – 2013 Научный редактор академик П.Г. Георгиев Атомно-силовая микроскопия как метод изучения с нанометровым разрешением морфологии поверхности объектов Храмцов Ю.В. Аннотация Атомно-силовая микроскопия (АСМ) в последнее время стала широко распространенным и зачастую незаменимым методом исследования морфологии и локальных свойств поверхности твердого тела с высоким пространственным разрешением. Этот метод входит в группу методов под названием сканирующая зондовая микроскопия. В сканирующих зондовых микроскопах топология поверхности и её локальные свойства исследуются с помощью наноразмерных игл или зондов [1]. С помощью специальной системы регистрации измеряется с точностью до долей нанометра взаимодействие зонда с каждой точкой исследуемой поверхности, а прецизионное перемещение зонда относительно поверхности обычно осуществляется с помощью пьезоэлементов. В 1981 году был изобретен сканирующий туннельный микроскоп (СТМ) – первый из семейства зондовых микроскопов. Этот метод привлек к себе широкое внимание после визуализации атомарной структуры поверхности ряда материалов, в частности, поверхности кремния и за него в 1986 году была присуждена Нобелевская премия [1]. В настоящее время существует много разных видов сканирующей зондовой микроскопии, например, магнитно-силовая микроскопия, электросиловая микроскопия, микроскопия поверхностного потенциала, сканирующая емкостная микроскопия, ближнепольная оптическая микроскопия и т.п. [2]. Наибольшее распространение получили методы сканирующей туннельной микроскопии и атомно-силовой микроскопии [3]. Сканирующая туннельная микроскопия ограничена только проводящими или полупроводящими поверхностями. Поэтому для исследования биологических объектов преимущественно применяется метод атомно-силовой микроскопии. Современные атомно-силовые микроскопы позволяют работать как в воздушной, так и в водной фазах. При этом, есть несколько разных режимов работы атомно-силового микроскопа. В данной работе описан атомно-силовой микроскоп фирмы Digital Instruments (США) с контроллером Nanoscope IIIa, который широко используется в различных лабораториях по всему миру. Описано строение и возможности данного микроскопа. В качестве примера приведено изучение полиплексов – комплексов катионных полимеров с молекулами ДНК в режиме прерывистого контакта АСМ в жидкой фазе. Работа в жидкости представляет особенный интерес с точки зрения молекулярной биологии и биофизики, т.к. позволяет изучать биологические объекты в их естественном, жидком окружении и минимизировать силу, с которой зонд воздействует на данные объекты. Используемый атомно-силовой микроскоп: мультимодальный сканирующий зондовый микроскоп (Digital Instruments, США), оснащенный контроллером Nanoscope IIIa (Veeco Instruments, USA) и J-сканером (максимальный размер скана 150×150 мкм). Микроскоп укомплектован ячейкой для работы в жидкости (Tapping Mode Liquid Cell), кантилеверами NP-S (oxide-sharpened silicon nitride) с номинальным радиусом кривизны зонда 10 нм и кантилеверами SNL (Sharp Nitride Lever) с номинальным радиусом кривизны 2–3 нм. Контактный режим атомно-силовой микроскопии Наиболее распространенными режимами работы атомно-силового микроскопа являются контактный режим и режим прерывистого контакта. В контактном режиме зонд, представляющий с собой микроиглу с радиусом кривизны кончика 2–60 нм, непосредственно взаимодействует с поверхностью образца (рис. 1). Зонд прикреплен к концу очень гибкого кантилевера в виде балки прямоугольного сечения (рис. 2 ) или образованного двумя балками треугольного кантилевера (рис. 2 ). Кантилевер, в свою очередь, прикреплён к жесткому, чаще всего кремниевому, основанию. К одному основанию могут быть прикреплены несколько кантилеверов с разной жесткостью (рис. 2 , справа). Кантилеверы чаще всего делают из кремния или нитрида кремния. Кремниевый кантилевер представляет собой балку прямоугольного сечения и используется, в основном, в режиме прерывистого контакта. Он имеет довольно высокий коэффициент жесткости, порядка 20-100 Н/м, поэтому крайне редко используется для изучения биологических объектов. Однако, зонды, кантилеверам, как имеют минимальный (3–10 т.е. позволяют жестких достичь наилучшего Треугольные кантилеверы нитрида наоборот, обладают довольно малыми коэффициентами жесткости всего используются изучения биологических объектов, как контактном так прерывистого контакта. Однако, недостаткам кантилеверов можно отнести относительно большой радиус кривизны зонда из нитрида этом являются кантилеверы номинальным радиусом зонда 10 Относительно недавно стали Рис . 1. Система обратной связи, поддерживающая постоянное отклонение кантеливера контактном режиме атомно силового ми кроскопа [2] . Рис . 2. Некоторые возможные типы зондовых датчиков, используемых АСМ треугольным кантилевером из нитрида кремния ( на рисунке права указаны коэффициенты жесткости размерностью Н/м) ( кремниевым кантилевером виде балки прямоугольного сечения ( [2] . Рис. 1. Система обратной связи, поддерживающая постоянное отклонение кантилевера в контактном режиме атомно-силового микроскопа [2]. 2. Некоторые возможные зондовых датчиков, используемых АСМ: треугольным кантилевером нитрида рисунке справа указаны коэффициенты жесткости размерностью ( кантилевером балки прямоугольного сечения доступны кантилеверы SNL (Sharp Nitride Lever), где балка сделана из нитрида кремния, а зонд из кремния (рис. 3). Это позволило совместить достоинства кантилеверов из кремния и нитрида кремния. А именно, добиться того, чтобы радиус кривизны зонда составлял 2–3 нм и кантилеверы обладали низкими коэффициентами жесткости (0,06-0,58 Н/м). Все это позволяет изучать биологические объекты в жидкости с высоким разрешением. В контактном режиме зонд сканирует поверхность образца, находясь в непосредственном контакте с ней. При этом, в зависимости от рельефа поверхности, меняется изгиб кантилевера. На верхнюю поверхность кантилевера падает луч лазера, который отражается на фотодетектор (рис. 1). Таким образом, изменение изгиба кантилевера фиксируется. За движение кантилевера относительно образца отвечает сканер на пьезоэлементах (рис. 1). Оператором задается некоторый изгиб кантилевера, который отвечает определённому значению сигнала с фотодетектора (setpoint). Система обратной связи в каждой точки поверхности (x, y) образца поддерживает постоянным значение этого изгиба с помощью вертикального (по оси z) движения сканера (рис. 1). Тем самым сила взаимодействия между зондом и образцом всегда остаётся постоянной и равной -kx, где k – коэффициент жесткости кантилевера, а x – изгиб кантилевера. При сканировании кантилевером из нитрида кремния сила взаимодействия зонда с образцом составляет обычно от нескольких Рис. 3. Полученное с помощью электронной микроскопии изображение зонда кантилевера SNL (Sharp Nitride Lever) ( ) и двух кантилеверов SNL на одном основании ). Номинальный радиус кривизны зонда составляет 2 нм. Коэффициенты жесткости кантилеверов составляют 0,12 и 0,58 Н/м, соответственно. наноньютонов до нескольких десятков наноньютонов. Оператором также задаются пропорциональное и интегральное усиления, которые задают скорость, с которой система обратной связи реагирует на изменение рельефа образца. Они регулируют напряжение, которое подается на пьезоэлемент, отвечающий за вертикальное движение сканера АСМ. Оптимизация этих усилений позволяет добиться наилучшего сканирования зондом исследуемой поверхности. Контактный режим атомно-силовой микроскопии обладает рядом преимуществ перед другими режимами. Он позволяет сканировать поверхность с высокой скоростью, что важно, например, при изучении протекания некоторых процессов в реальном времени. Кроме того, образцы с сильными вертикальными изменениями топографии проще всего сканировать именно в контактном режиме. Помимо этого, только в контактном режиме можно достичь атомарного разрешения исследуемой поверхности. Однако этот режим имеет и существенные недостатки: при постоянном контакте зонда с поверхностью при их относительном движении возникают латеральные силы или, иными словами, силы трения. Кроме того, на воздухе, нормальная составляющая взаимодействий зонд-образец увеличивается за счёт капиллярных сил от абсорбированного на образце слоя жидкости. Латеральные силы совместно с высокой нормальной составляющей силы зонд- образец могут привести к сильному нарушению структуры мягких образцов, попросту говоря, поцарапать их. Эта проблема частично снимается в жидкости, где нормальная составляющая силы зонд-образец существенно ниже. Тем не менее, биологические образцы обычно снимаются с помощью самых гибких кантилеверов, с относительно невысокими линейными скоростями сканирования. В качестве примера работы в контактном режиме на атомно-силовом микроскопе с контроллером Nanoscope IIIa (Veeco Instruments, USA) можно привести изучение взаимодействия модульного рекомбинантного нанотранспортера (МНТ), содержащего транслокационный домен дифтерийного токсина, с липидным бислоем [4–6]. Только благодаря этому режиму работы при рН 5,5 удалось наблюдать возникновение в липидном бислое под действием МНТ крупных (50–200 нм диаметром) флуктуирующих пор, глубина которых отвечает толщине липидного бислоя (3,5–5 нм) [4–6]. Режим получения силовых кривых атомно-силовой микроскопии Для изучения взаимодействия зонда кантилевера с исследуемым образцом используют силовые кривые (рис. 4). При этом сканирование в плоскости образца (x, y) прекращается, а осуществляется только вертикальное движение сканера. Силовые кривые представляют собой зависимости отклонения кантилевера (используя константу жесткости кантилевера можно рассчитать силу) от величины вертикального перемещения сканера микроскопа (рис. 4). По кривой, отвечающей за контакт зонда с образцом (рис. 4, S), можно определить эластические свойства образца, а по точке отрыва зонда от образца (рис. 4, D), оценить силу взаимодействия между зондом и образцом. Рис. 4. Характерный вид силовых кривых АСМ [7]. Показаны основные стадии процесса: А- кантилевер не взаимодействует с поверхностью. В-«залипание» зонда кантилевера на поверхности, S- зонд кантилевера на находится на поверхности, С- искривление кантилевера при его удалении от поверхности за счет взаимодействия зонда с образцом, D- отрыв зонда от поверхности образца. Силовые кривые позволяют изучить взаимодействия между различными биомолекулами, т.к. одну молекулу можно присоединить к зонду кантилевера (например, антитело), а другая молекула (например, антиген) будет адсорбирована на поверхности подложки. Этот метод позволяет получить информацию о силе взаимодействия между молекулами с точностью до нескольких десятков пиконьютонов. Например, в работе [5] с помощью атомно- силового микроскопа с контроллером Nanoscope IIIa (Veeco Instruments, USA) была изучена сила взаимодействия между антителами и МНТ, содержащим транслокационный домен дифтерийного токсина. Причем по полученным силовым кривым изучили взаимодействие зонда, на поверхности которого были связаны антитела, как с липидным бислоем, так и с молекулами МНТ, встроенными в липидный бислой [5, 6]. При этом, выделены специфические и неспецифические взаимодействия между антителами и МНТ. Оказалось, что средняя сила специфического взаимодействия МНТ-антитело составляет 192 ± 23 пН, что характерно для специфических взаимодействий антиген-антитело [6]. Режим прерывистого контакта атомно-силовой микроскопии В режиме прерывистого контакта, кантилевер совершает вынужденные колебания с помощью специального пьезоэлемента (рис. 5). Кантилевер обычно колеблется с частотой несколько ниже резонансной с амплитудой порядка 20– 100 нм. При сканировании зонд лишь «стучит» по поверхности образца, что обусловливает название данного режима. Амплитуду колебаний кантилевера можно определить по сигналу с фотодетектора, на который падает луч лазера, отражённый от кантилевера (рис. 5). Рис. 5. Система обратной связи, поддерживающая постоянную амплитуду колебаний кантилевера в режиме прерывистого контакта атомно-силового микроскопа [2]. Оператор рабочую амплитуду колебаний контактном режиме, так и в режиме прерывистого контакта. Если смотреть снизу, то в центральной части ячейки находится углубление, в которое помещается основание, содержащее кантилеверы (рис. 6 ). После этого, основание фиксируется в углублении специальным держателем (рис. 6 Жидкостная ячейка содержит пьезоэлемент (рис. 6 слева и рис. 6 снизу), вызывающий колебания ячейки, а, следовательно, и кантилеверов. Для обеспечения герметичности жидкостной ячейки в нее вставляется кольцо (O- ring) (рис. 7 ). Далее к ней подсоединяются шланги, подводящие и отводящие выбранный раствор (рис. 7 ). С помощью клея, кусочек слюды прикрепляется к металлическому диску диаметром 1 см, который затем помещается на сканер атомно-силового микроскопа (рис. 7 ). С помощью липкой ленты проводится расщепление слюды и сразу же на неё наносится 100 мкл ранее приготовленного раствора исследуемых биомолекул. Поверхность свежерасщепленной слюды заряжена отрицательно, что позволяет связывать положительно заряженные биомолекулы. Если нужно посадить отрицательно заряженные биомолекулы, то в состав буфера включают бивалентные ионы, такие как Ni или Mg Рис. 6. Характерный вид жидкостной ячейки атомно-силового микроскопа фирмы Digi tal Instruments (США), предназначенной как для работы в контактном режиме, так и в режиме прерывистого контакта [11]. Показан вид сверху ) и снизу ( Жидкостная ячейка, помещенная сканирующую головку атомно-силового микроскопа Digital Instruments оснащенная подводящими отводящими заполненная буфером [1 Показан помещенной сканирующую головку микроскопа ( схематическое изображение заполненной жидкостью ячейки ( инкубации раствора биомолекул слюде жидкостная ячейка вставляется сканирующую головку атомно-силового микроскопа 7 Кантилевер помощью микровинтов вручную подводится настолько близко поверхности, чтобы произошло «залипание» зонда кантилевера слое раствора, нанесенного поверхность слюды. Это обеспечивает достаточно плотный контакт кольца жидкостной поверхностью слюды, самым создавая герметичность полученной Далее, помощью подводящих шлангов, ячейка промывается соответствующим буфером, что позволяет удалить весь воздух связавшийся слюдой материал. помощью светового микроскопа проводится настройка лазерного кантилевер ( ручки настройки показаны 8 сверху). Также настраивают положение детектора так, чтобы выходной сигнал максимальным. Затем, частоты колебаний пьезоэлемента, находится резонансная частота колебаний кантилевера. кантилевера, колеблющийся резонансной частотой, приводится контакт поверхностью Амплитуда колебаний кантилевера настраивается таким образом, чтобы, одной стороны, минимизировать силу, которой зонд действует другой стороны, обеспечить надежное сканирование поверхности. Настраивается система обратной связи пропорционального интегрального затем производится получение изображений биомолекул, связавшихся слюдой. качестве использования режима прерывистого контакта атомно- силового микроскопа контроллером Nanoscope IIIa водной можно предложить уже рассмотренное изучение взаимодействия бислоем Режим прерывистого контакта среды позволил наблюдать образование липидном бислое, содержащем МНТ, кольцевых структур характерным диаметром 30–50 что указывает склонность олигомеризации бислое Используя параметры кольцевых структур гидродинамический диаметр МНТ, что среднем структуры образованы 11±2 молекулами качестве другого использования данного атомно-силового микроскопа прерывистого контакта рассмотрим изучение строения полиплексов – комплексов катионных полимеров молекулами Катионные полимеры основе полиэтиленимина являются одним наиболее перспективных вариантов невирусных носителей доставки Полиэтиленимин эффективно компактизует предохраняя от нуклеаз. Однако является высокотоксичным клеток. снижения токсичности полиплексов можно использовать конъюгаты полиэтиленгликолем улучшения Изображения строения полиплексов, приготовленных буфера ( ( полученные прерывистого контакта атомно-силового микроскопа с контроллером Nanoscope IIIa. Размер скана составляет 3×3 мкм. эффективности преодоления полиплексов состав конъюгата может включен мембранно-активный компонент, например, ТАТ-пептид – участок трансактиватора транскрипции 1 который одновременно является сигналом локализации. Полиплексы на основе ПЭИ-ПЭГ-ТАТ могут, например, быть предназначены для местного применения при терапии злокачественных новообразований. Строение полиплексов сильно влияет на эффективность, с которой они трансфицируют клетки. Оказалось, что это строение сильно зависит от рН буфера, используемого для приготовления полиплексов (рис. 8). Так если при рН 7,5 образуются компактные полиплексы слегка вытянутой формы, то при рН 5,0 полной компактизации плазмидной ДНК не наблюдается и видны ее характерные петли на изображениях полиплексов (рис. 8). По сравнению с рН 5,0 при рН 6,0 доля компактных полиплексов возрастает, в то время как доля частично компактизованных полиплексов уменьшается (рис. 8). Таким образом, описаны общие принципы работы на атомно-силовом микроскопе фирмы Digital Instruments (США) с контроллером Nanoscope IIIa в контактном режиме, режиме съемки силовых кривых и режиме прерывистого контакта. В качестве примеров работы на этом микроскопе приведены исследование взаимодействия модульных нанотранспортеров, содержащих транслокационный домен дифтерийного токсина, с липидным бислоем, а также изучение строения полиплексов – комплексов катионных полимеров с молекулами ДНК. Основное внимание уделялось работе данного микроскопа в жидкой фазе. Используемая литература 1. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Учебное пособие для студентов старших курсов высших учебных заведений. Институт физики микроструктур РАН, Нижний Новгород, 2004. 2. Scanning Probe Microscope. Training Handbook. Part number 004-130-000 (Standard). Veeco Instruments Inc., 2003. 3. Santos N.C., Castanho M.A.R.B. An overview of the biophysical applications of atomic force microscopy // Biophys. Chem. 2004. V. 107. P. 133–149. 4. Gilyazova D.G., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Lunin V.G., Sergienko O.V., Khramtsov Y.V., Timofeyev K.N., Grin M.A., Mironov A.F., Rubin A.B., Georgiev G.P., Sobolev A.S. Targeting cancer cells by novel engineered modular transporters // Cancer Res. 2006. V. 66. № 21. P. 10534–10540. 5. Khramtsov Y.V., Rokitskaya T.I., Rosenkranz A.A., Trusov G.A., Gnuchev N.V., Antonenko Y.N., Sobolev A.S. Modular drug transporters with diphtheria toxin translocation domain form edged holes in lipid membranes // J. Contr. Release. 2008. V. 128. P. 241–247. 6. Розенкранц А.А., Храмцов Ю.В., Трусов Г.А., Гнучев. Н.В., Соболев А.С. Исследование механизма образования пор в липидных бислоях модульными нанотранспортерами, содержащими транслокационный домен дифтерийного токсина // ДАН. 2008. Т. 421. № 6. С. 835–837. 7. Atomic Force Microscopy: Biomedical Methods and Applications. From: Methods in Molecular Biology, vol. 242. Edited by: Braga P.C. and Ricci D. Humana Press Inc., Totowa, NJ., 2003. 8. Frederix P.L.T.M., Akiyama T., Staufer U., Gerber Ch., Fotiadis D., Muller D.J., Engel A. Atomic force bio-analytics // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. V. 7. P. 9. Zlatanova J., Lindsay S.M., Leuba S.H. Single molecule force spectroscopy in biology using the atomic force microscope // Progress in Biophysics & Molecular Biology. 2000. V. 74. P. 37–61. 10. Stark M., Moller C., Muller D.J., Guckenberger R. From images to interac tions: high-resolution phase imaging in tapping-mode atomic force microscopy // Biophys. J. 2001. V. 80. P. 3009–3018. 11. MultiMode SPM Instruction Manual. NanoScope Software Version 5. Part numbers 004-210-000 and 004-210-100. Veeco Instruments Inc., 2004. 12. Slastnikova T.A., Rosenkranz A.A., Gulak P.V., Schiffelers R.M., Lupanova T.N., Khramtsov Y.V., Zalutsky M.R., Sobolev A.S. Modular nanotransporters: a multipurpose in vivo working platform for targeted drug delivery // Int. J. Nanomed. 2012. V. 7. P. 467–482. 13. Brus C., Petersen H., Aigner A., Czubayko F., Kissel T. Ef�ciency of polyeth ylenimines and polyethylenimine-graft-poly(ethylene glycol) block copolymers to protect oligonucleotides against enzymatic degradation // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004. V. 57. P. 427–430.

Приложенные файлы

  • pdf 32548223
    Размер файла: 4 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий